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    分子實(shí)驗(yàn)-免疫熒光基本實(shí)驗(yàn)步驟(基本步驟與技巧)

    發(fā)布時(shí)間: 2023-03-20  點(diǎn)擊次數(shù): 2130次

    分子實(shí)驗(yàn)-免疫熒光基本實(shí)驗(yàn)步驟(基本步驟與技巧)

      免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測(cè)定含量。

      免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備(通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片)是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步,細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要,原因很簡(jiǎn)單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力,有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門,非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?,合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步驟是類似的,最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體,因此必須謹(jǐn)記避光操作,此外,抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

      由于操作步驟比較多,同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無(wú)法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別,所以要得到一個(gè)免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果,除了需要高質(zhì)量的抗體,以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外,還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照??傊?,免疫熒光實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照,每步都非常關(guān)鍵,需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量,才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>


      免疫熒光實(shí)驗(yàn)基本實(shí)驗(yàn)步驟:

      細(xì)胞準(zhǔn)備

      對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

      固定

      根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮鈉的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3*5次。

      通透

      使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3*5min。

      封閉

      使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉,時(shí)間一般為30min。

      一抗結(jié)合

      室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。

      二抗結(jié)合

      間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。

      封片及檢測(cè)

      滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。

      免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟技巧

      封閉:

      將組織切片自-20℃冰箱取出,室溫靜置15 min(可采用免疫熒光封閉用筆在組織周圍畫圈以避免抗體擴(kuò)散),隨后采用1×PBS洗三次,每次5 min,最后采用blocking buffer(綿羊血清5%,0.3%Triton-100,采用1×PBS稀釋可得)室溫封閉1 h。

      一抗孵育:

      濾紙吸掉玻片上的封閉液(吸取的時(shí)候要注意不要碰到組織樣本),并滴加blocking buffer配置的待測(cè)抗體,將玻片置于濕盒中,4℃孵育過(guò)夜。既然是濕盒,應(yīng)該都知道里面要加水防止抗體蒸發(fā)的吧,嗯嗯,聰明的你們肯定知道。

      二抗孵育:

      第二天把濕盒從冰箱拿出來(lái)(一般來(lái)說(shuō)大部分的染色可直接做下面的步驟,如果待測(cè)蛋白比較難染色,可將濕盒置于室溫繼續(xù)孵育一段時(shí)間,時(shí)長(zhǎng)自己定),回收一抗(土豪的話就隨意),1×PBS滴加到玻片上,洗三次,每次3 min,隨后吸取多余的1×PBS。

      接下來(lái)所有的操作均在避光條件下進(jìn)行,這很重要!

      滴加二抗(同樣用blocking buffer配置哦),室溫孵育1 h。

      染核:

      吸掉二抗,滴加DAPI孵育3-5 min,1×PBS同上方法洗三次。

      最后用濾紙吸取多余的液體,用含有抗淬滅劑的封片劑封片(有小伙伴用指甲油,也行),避光保存后即可在顯微鏡下觀察染色的情況。

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